• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1988004321A1
    申请号:PCT/JP1987/000938
    申请日:1987-12-03
    公开日:1988-06-16
    发明作者:Akio Matsukage；Masamitsu Yamaguchi；Takayasu Date
    申请人:Mitsui Toatsu Chemicals, Inc.；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書 大腸菌による哺乳類 DNAポリメラ一ゼ 3の産生法とそ の産生大腸菌株 技 術 分 野
    [0002] 本発明は、 D NA の合成に必要な酵素であ り 、 生化 学、 分子生物学、 遺伝学、 癌研究等の諸分野での基礎 研究においてのみならず、 遺伝子工学における実用面 あるいは工業的な観点から非常に有用な D NA ポリ メ ラーゼに関し、 特に、 動物が産生する特定構造の DNA -ポリメ ラーゼに関する。 本発明は更に、 該 DNA ポリメ ラーゼをコードする DNA 配列、 該配列を用いた組換え 体プラスミ ド、 該換え体プラスミ ドを用いて形質転換 した宿主細胞、 該細胞を培養することによる DNA ポリ メ ラーゼの生産方法及びそのよ う に して生産された DNA ポリメラ一ゼの分離精製方法に関する。
    [0003] . 背 景 技 術
    [0004] DNA ポリメラーゼ （デォキシヌクレオシ ド 3 リ ン酸 ： D NA デォキシヌク レオチディ リレ ト ランスフヱラー ゼ、 E C 2. 7. 7. 7 ) は、 細胞の遺伝物質である DMAが合 成される際に必要とされる酵素であり、 生化学、 分子 生物学、 遺伝学、 癌研究等の諸分野での基礎研究のみ ならず、 遺伝子工学における実用面あるいは工業的な 観点から非常に有用な酵素であり、 生命科学の発展に 大きな役割を果している。
    [0005] すなわち、 例えば近年急速に開発された遺伝子工学 技法は、 生物の持つ任意の遺伝子の単離 （クローニン グ） と、 その遺伝子によつて支配されている蛋白質 を、 例えば大腸菌や動物細胞等の適当な宿主菌に生産 させることを可能にしたが、 この分野においても、 こ の DNA ポリメラーゼは DNA 合成用の試薬として頻用さ れており、 その需要はさらに拡大しつつある。
    [0006] この DNA ポリメラーゼとしては、 従来より細菌由来 の DNA ポリメラーゼ I及びその部分分解物であるクレ ノ ウフラグメン ト （ k lenow fragment)、 いわゆるクレ ノ ウ酵素が用いられてきており、 特にクレノ ゥ酵素の 使用頻度がより多いのが現状である。
    [0007] ところで、 前記の大腸菌由来の DNA ボリメラーゼ I は、 ポリメラーゼ活性とともに、 DM 分解酵素活 性、 すなわち 5' → 3' ェキソヌクレアーゼ活性及び 3' → 5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を有しており、 ま たクレノ ウ酵素も 3 ' - 5' ェキソヌク レアーゼ活性 を有しているため、 これらを用いた DNA 合成において は、 合成 DNA の一部分解が避けられないという問題点 力 あった。
    [0008] 一方、 ラ ヅ トゃヒ トなど、 動物の細胞の DNA ボリメ ラーゼ （動物細胞を含む真核細胞には、 複数の DNA ポ リメ ラーゼがあり、 これらは、 DNA ポリメ ラ一ゼ α 、 β、 丫 と称されている） には、 ェキソヌク レアーゼ活 性がないことが知られているが、 その量は、 例えば全 蛋白質の 1 万〜 1 0万分の 1 と極微量であり、 細胞か らの抽出精製による方法では、 DNA ポリメ ラーゼを大 量に得る こ と は困難であ り 、 工業的にも実用的でな い。
    [0009] これら動物細胞由来の D N Aポリメ ラーゼの中で、 ラ ヅ 卜 由来の DNAポ リ メ ラーゼ ） 3 (以後 DNAポ リ メ ラ一ゼ 13 を ροβ — β と略称する） の遺伝子のクローン 化については Zmudzka, B. Z.及び松影 （本発明者らの一 人） らによって cDNAの形でクローン化されたものがあ る ( Zmudzka, B. Z. , et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.83, pp. 5106. July 1986) 。 このクローン化され たラ 、ソ 卜 po - 13遺伝子は、 1197塩基対よ り なり、 そ のう ちの 954 塩基対からなる暗号読み枠が 318 ァミノ 酸残基からなる蛋白質を規定するものであった。
    [0010] 本発明者らによるこのクローン化ラ ッ 卜 po^ — /3遺 伝子の構造についての検討によれば、 ラ ッ 卜及びニヮ 卜 リ から直接分離精製した ρο ー 13 のアミ ノ酸配列 と、 このクローン化 ρο — /3遺伝子によってコー ドさ れる 318 アミノ酸残基からなる蛋白質のアミノ酸配列 はほぼ一致しているものの、 このクローンィヒラ ヅ 卜 ρο Ά一 j3遺伝子を適当なベクターに挿入して形成した組 換え体プラスミ ドを大腸菌に導入して、 該遺伝子の発 現を試みたところ、 得られた蛋白質にはラ ッ 卜 Ρ0 一 <3活性がないことが判明した。
    [0011] 一方、 匕卜 ρο £ 一 0 のクロ一ニングに関しては、 SenGupta. D. N. et al , Biochem. Biophys. Res. Comraura. , H , 341〜 347, 1986に開示されているが、 本発明者ら による同様の検討によれば、 ここで得られている cDNA もまた不完全なものであることが判明した。 発 明 の 開 示
    [0012] 本発明者らは、 上記のような問題点に鑑み動物細胞 由来の DNA ポリメラーゼについて種々の検討を加えた 結果、 DNAポリメラーゼは、 ヒ 卜、 哺乳類、 鳥類、 両 性類、 魚類等の種々の動物の細胞で生産されており、 これらの動物細胞の DNA ポリメラーゼをコードする遺 伝子をクローニングして、 組換え DNA を形成し、 これ を適当な宿主細胞中に導入して発現させることによつ て、 動物細胞由来の DNAポリメラーゼを大量に生産で きるとの結論に至り、 鋭意検討を進め本発明を完成し た。
    [0013] すなわち本発明の目的は、 生化学、 分子生物学、 遺 伝学、 癌研究等の諸分野での基礎研究においてのみな らず、 遺伝子工学における実用面あるいは工業的な観 点から非常に有用な、 ヌクレアーゼ活性のない動物細 胞由来の DNAポリメ ラーゼを提供することにある。
    [0014] 本発明の他の目的は、 動物細胞由来の DNAポ リ メ ラーゼを高収率で生産する方法、 それに用いるのに有 用な DNAポリメ ラ一ゼ生産株及び該株を培養して得た 菌体から高収率で DNAポリメラーゼを分離精製できる 方法を提供することにある。
    [0015] 本発明者らは、 上記の目的を達成するために、 ま ず、 前述の 3種の DNAポリメラ一ゼのうち DNAポリメ ラーゼ 3が、 4 OkDa (キロダルト ン） の一本鎖からな り、 最も単純な構造を有し、 またラッ 卜及びヒ 卜由来 の · DNAポリメ ラーゼ 13 にはヌクレア一ゼ活性がないこ とに着目し、 それらの構造及び機能について種々検討 を加えた。
    [0016] 本発明者らは、 これらの検討のなかで、 前述の松影 らによるクローン化ラッ 卜 ρο ·2 - 遺伝子を大腸菌で 発現させて得られた蛋白質における ρο £ — ]3活性の欠 如の問題について、 更に詳細な検討を加えた。 具体的 には、 常法に従って、 ラ ツ 卜 ρο ·2 — ）3遺伝子を、 ラ ヅ 卜の染色体から分離し、 その DNA 配列を検索したとこ ろ、 上述のクローン化ラッ 卜 Ρ Ο ·β — jS遺伝子によって 支配されるアミノ酸配列では、 DNA ポリメラーゼのボ リペプチ ド構造と しては不完全であり、 すなわち N-末 端側の 17アミノ酸残基が足りず、 その原因がクローン 化した DNA 配列に 9塩基に相当する欠損部分が生じて いる （第 4図の塩基配列の最初の 9塩基） との知見を 得た。
    [0017] そこで、 本発明者らは、 上記欠損部分や不完全部分 を補う手法を確立して、 ρο — /3活性を有するポリべ プチ ドをコードする DNA 配列の合成に成功し、 また該 配列を用いた遺伝子工学的手法によつてアミノ酸残基 数 335 からなるラ ヅ 卜ゃヒ 卜 DNAポリメラ一ゼを高収 率で得られる方法を確立するに至り本発明を完成し た。
    [0018] 上記目的を達成する本発明は、 特許請求の範囲第 1 項に記載のアミノ酸配列を有する動物細胞由来の？ 0 一 β 、 該 po - j3をコードする DNA 配列、 該 DNA 列を 用いた組み換え体プラスミ ド、 該組み換え体ブラスミ ドによ り形質転換ざれた細胞、 該形質転換体を用いた O JG - |3の生産方法およびそのようにして生産された o^一 の精製方法を含む。
    [0019] 本発明によって、 DNA 合成酵素活性が高く、 ヌクレ ァ一ゼ活性のない動物細胞由来の D ポリメラーゼを コードする DNA 配列がクローン化され、 更にそれを適 当なベクターとともにプラスミ ド中に組換え、 大腸菌 等の宿主細胞内に導入して発現させることによって、 例えば 20%という高い収率での該 DNA ポリメラーゼの 生産が可能となった。 一 フ ー また、 本発明によって、 宿主細胞に生産させた DNA ポリメ ラーゼを、 宿主細胞の培養系から純粋な形で収 率良く分離精製することが可能となり、 純粋な DNA ポ リ メ ラーゼの大量生産が可能となった。
    [0020] なかでも、 動物細胞由来の DNA ポリ メ ラーゼ |3の例 と して、 本発明者らはニヮ ト リ、 ラッ 卜、 ヒ 卜などに 由来するものを検討し、 ラッ 卜のアミノ酸配列は、 ヒ 卜のそれと 9 5 %の相同性を有していることから、 まず ラ ッ 卜 DNA ポリメラーゼ /3遺伝子のクロ ー ン化と遺伝 子工学的手法によるその発現を企て、 そしてそれに成 功した。 しかも、 そこで得られたラ ッ ト DNA ポ リ メ ラーゼ ί3 は、 均一であり、 その酵素活性は十分に高い ものであっ た。 この結果は、 更に、 本発明によれば ラ ヅ 卜以外のニヮ ト リ、 ヒ 卜などの DNA ポリメラーゼ の遺伝子工学的手法による宿主細胞中での発現と、 該 DNA ポリメラーゼの純粋な形での大量生産が可能とな ることを裏付けている。
    [0021] —方、 従来よ り繁用されている大腸菌由来の DNA ポ リメラ一ゼ I ゃク レノ ウ酵素がヌクレアーゼ活性を持 つのに対して、 本発明によ り得られた DNA ポリメラー ゼ ί3 にはヌク レアーゼ活性がない。 従って、 本発明に よ り得られた DNA ポ リ メ ラーゼを用いた D NA 合成で は、 3 ' 末端を完成する ことができるので、 ヌク レ ァ一ゼ活性を必要と しない、 あるいはヌクレアーゼ活 性を所望しない DNA 合成に直接使用でき、 かつ純粋な 形で大量生産可能であるので、 D A ポリメラ一ゼに対 する拡大しつつある需要に十分対応できるものであ る。 図面の簡単な説明
    [0022] 第 1 図は、 本発明の DNA ポリメラ一ゼ発現用プラス ミ ドの構築過程を示した図、 第 2図は本発明の実施例 1 の（1 ) 項で得たプラスミ ドにおけるラ ッ 卜 DNA ポリ メ ラーゼ 13遺伝子の一部からなる DNA フラグメン 卜の 挿入方向を示した模式図、 第 3図は本発明における部 位特異的突然変異誘発過程を示した図、 第 4図は本発 明の実施例 1で'得たラッ ト DM ポリメラーゼ /3をコー ドする D NA 配列における塩基配列及びそれによつて コー ドされるアミノ酸配列を示す図である。 なおこれ らの第 4 A図〜第 4 D図は違続したもので 1 つの配列 を示している。
    [0023] また、 これらの図中、 P.はプロモーター、 0.はオペ レーター、 S Dはシャィン ♦ ダルガーノ配列、 MC S はマ ルチクローニングサイ 卜 （ポリ リンカ一部位） 、 Fは 電気泳動における移動速度の速い部分、 Sはそれが遅 い部分をそれぞれ示す。
    [0024] 発明を実施するための最良の形態
    [0025] 本発明の動物細胞由来の DNAポリメラーゼをコード する DNA 配列は、 DNAポリメラーゼを産生する各種動 物細胞の DNA ポリメ ラーゼ遺伝子に含まれる DNAポリ メラ一ゼをコー ドする DNA 配列をクローンィヒすること によって得ることができる。
    [0026] この動物細胞と しては、 サケ、 マス、 力エル、 ニヮ ト リ 、 マウス、 ラ ヅ 卜 、 モルモッ ト 、 ブタ、 ヒ ヅジ、 ゥシ、 サル、 ヒ 卜等を挙げることができる。
    [0027] なかでも、 ヌク レア一ゼ活性を有していない DNA ポ リメ ラーゼを得るには、 先に述べたよう にラ 、ソ 卜及び ヒ 卜等の細胞が好適である。
    [0028] なお、 所望の DNA ポリメラーゼをコードする DNA 配 列をクローン化する方法と しては、 例えば、 後述の実 施例 1 に示されたよう な本発明者らによって確立され た方法が有用である。
    [0029] すなわち、 従来の DNA ポリメラーゼ遺伝子のクロ一 ンィ匕によって得られていた DNA 配列 （二本鎖） には、 上述のよう に欠損部分や不完全部分が存在する。 そこ で、 まず、 補充すべき部分と相補性を有する塩基配列 の両側に、 該補充部分が、 それが補充されるべき DNA 配列 （被補充 DNA 配列） に補充された際の該補充部分 の両側の D N A 配列に相補性を有する塩基配列をそれぞ れ結合させた一本鎖の DNA 断片を合成しておく 。 次 に、 被補充二本鎖 DNA 配列を一本鎖と し、 先に用意し た補充部分保有の一本鎖 DNA 断片と反応させる。 すると、 補充部分保有の DNA 断片は、 その両側に、 被補充 DNA 配列の上述したような補充部分の両側の塩 基配列と相補性を有する塩基配列を有しているので、 それらの部分から被補充 DNA と結合する （該結合部分 は二本鎖となる） 。
    [0030] そこで、 前記 断片の結合部分間に、 部位特異的 突然変異を起させる。 すると、 被補充一本鎖 DNA 配列 のこれら結合部分間に、 補充すべき部分に相補性のあ る塩基配列を含む合成ヌクレオチドが形成され、 それ によって補充すべき所定の相補的な塩基配列を有し、 二本鎖からなる DNA 配列を得ることができる。
    [0031] このような、 一本鎖 DNA の状態の被補充 UNA 配列に 部位特異的突然 異を起して、 必要部分を補充する方 法は、 上記のような欠損部分や不完全部分が存在する DNA 配列のみならず所定の DM 配列と相同部分を有す る DM 配列等に不足部分を補って、 所望の DNA 配列を 得るのに好適であり、 例えば、 所望とする DNA 配列を 完全な形でクローン化できなくても、 該方法によりそ の不完全な部分を補充することができる。 上記のこれ らの手法をミスマッチプライマー法と称する。
    [0032] なお、 後述の実施例 1 は、 ラッ 卜からのラ ッ 卜 po 一 13 をコードする DNA 配列のクローン化を示したもの であるが、 この方法は、 DNAボリメラーゼを産生する 他の上述の各種動物細胞からの DNA 配列のクローン化 にも適用できる。
    [0033] このよ う にしてクローン化した DNA ポ リ メ ラ一ゼを コー ドする DNA 配列は、 本発明者らによって新たに構 築されたものであ り 、 これによ り 、 DNAポ リ メ ラ一ゼ 生産用の組換え体 DNA を形成する こ とが可能とな り 、 DNAポ リ メ ラ一ゼの大量生産が可能となつ た。
    [0034] 次に、 本発明の D NAポ リ メ ラ一ゼをコー ドする DNA 配列を用いた DNAポ リ メ ラ一ゼの生産方法について説 明する。
    [0035] この D NAポ リ メ ラ一ゼの生産方法に用いる こ とので きる宿主細胞と しては、 例えば、 大腸菌、 放線菌、 枯 草菌等の細菌や酵母などの微生物、 サケ、 マス、 ニヮ ト リ 、 マウス、 ラ ッ 卜 、 モルモヅ '卜 、 ヒ ヅ ジ、 ゥ シ、 サル、 ヒ 卜等の細胞などを挙げるこ とができ る。
    [0036] 本発明の DNAポ リ メ ラーゼをコー ドする DNA 配列を 組込むベク ターと しては、 用いる宿主細胞内で複製可 能であ り 、 DNAポ リ メ ラーゼの宿主細胞での発現を可 能とする ものであれば、 どのよ う なものでの利用でき る。 そのよ う なベク ターと しては、 例えば acオペ口 ン · プロモーターを有するベク ター、 t ac プロモー ターを有する p K K 322 ベクター、 t rp オペロン ♦ ブロ モーターを有するベクター等が挙げられる。
    [0037] 更に該ベク ターは、 必要に応じて上述のよ う なよ う なプロモーターに加えて、 アンピシリ ン、 テ 卜 ラサイ ク リ ン、 カナマイシン等に対する耐性を支配するマー カーを含んでいても良い。
    [0038] また、 該ベクターとして P UC 118 (宝酒造社製） 等の ファージを加えることにより一本鎖になる性質を有す るプラスミ ドを用いた場合、 ただちに部位特異的突然 変異部分を含む合成ォリ ゴヌクレオチドプライマーと 結合できるので、 ミスマッチプライマ一法によ り 目的 とする置換、 挿入、 削除等の操作の入った塩基配列の 二重鎖 DNA が得られ、 これを適当な宿主に導入して、 新たな生理活性を有するタンパク質を発現させること が可能となる。 なお、 PTZ 18 R、 pTZ 19 R (フアルマシア 社製） 等の上記めような一本鎖となる性質を有する他 のベクターもこれら目的に利用し得る。
    [0039] このような構成のベクターに、 常法に従い適当な制 限酵素切断部位を利用して、 必要に応じてリ ンカ一等 を用い本発明の DNAボリメラーゼをコードする DNA 配 列を組込むことによって、 DNAポリメラーゼ生産用の 組換え体 DNA を形成することができる。
    [0040] なお後述の実施例 1 で得られた組換え体 DNA は、 そ れ自身が DNAポリメラーゼ生産用として特に好適なも のであり、 本発明者らによって新たに構築されたもの である。
    [0041] 本発明の DNAポリメラーゼをコードする DNA 配列を 含む組換え体 DM を、 宿主細胞にト ラ ンスフ クショ ンするには、 例えば、 塩化カルシウム法、 リ ン酸カル シゥム法、 プロ 卜プラス 卜融合法等の方法が利用でき る。
    [0042] このよう にして組み換え体 DNA を宿主細胞に 卜 ラン スフエクシヨ ンして、 それを形質転換し、 該形質転換 された宿主細胞を培養する こ と に よ っ て DNAポ リ メ ラーゼを生産するこ とができる。
    [0043] 例えば、. 以後の実施例 2で示されているよう に本発 明の方法によ り、 菌体中の全蛋白質量の 19. 3 %に達す る DNA ポリメ ラ一ゼの生産が実現された。
    [0044] なお、 上記の方法において宿主細胞に生産させた DNAポリ メ ラーゼは、 以下に詳述'する方法によって、 ' 精製する こ とができ る。
    [0045] ちなみに、 本発明者らは、 これまでの各種の DNA ポ リメ ラ一ゼの構造と機能についての研究を行なってき たが、 動物細胞中では DNA ポリメラ一ゼが極微量にし か存在せず、 その分離精製は非常に困難であった。 し かしながら、 本発明者らは、 1 0段階程度の操作を組合 せて単一な DNA ポリメラ一ゼの取得に成功した。
    [0046] 具体的には、 本発明者らは、 DNA ポリメラーゼが塩 基性のタンパクであること及び夾雑の DNA 等核酸類を 除去することを考慮して、 まず D EAE セルロースのよ う な陰イオン交換担体で DNA ポリメラーゼを含む菌体 抽出液等の混合物を処理することが必要であるとの結 論に至つた。
    [0047] 次に、 この陰ィォン交換担体を素通り した画分をリ ン酸セルロース酸性担体に吸着させ、 溶出液の塩濃度 の差異によって DNA ポリメラーゼを分離精製すること を ί亍なった。
    [0048] そして最後に、 DM カラムによるァフィ二ティーク ロマ 卜グラフにより、 更に、 DNA ポリメラ一ゼを精製 した。 . なお、 この分離精製方法は、 上記の主要過程に加え て、 ゲル口過を含め種々の操作が加えられ、 動物細 胞由来の超微量の DNA ポ リメラーゼは分離精製され
    [0049] これに対し、 本発明においては、 細菌等'において動 物 DNA ポリメラーゼが大量に生産されるので、 DNA ポ リメラーゼを含む粗生産物が大量に得られ、 本発明者 らは前記の主要な 3つの過程の操作以外の種々の操作 を省略し、 すなわち特に γ効なこれら操作のみを組合 せて、 その操作過程を大幅に単純化した新たな精製方 法を確立した。
    [0050] 第 1 の主要過程で用いる陰ィオン交換担体と して は、 D EAEセルロース、 TEAEセルロース、 D EAEセフ ァ デッ クス、 αΑΕ セフ アデヅ クス、 セフ ァセル、 Dowex- 1 などが挙げられる。
    [0051] また第 2の主要な過程で用いる酸性担体 （陽イオン 交換体） と しては、 リ ン酸セルロース、 CMセル口一 ス、 SEセルロース、 CMセフアデヅクス、 ノ、イ ドロキシ ァパタイ 卜、 Dowex-50などが挙げられる。
    [0052] 更に、 第 3の主要過程で用いるァフ ィ二ティーク口 マ 卜グラフ と しては、 DNA セルロースあるいはブル一 ァガロースなどを用いることができる。
    [0053] これら主要の過程の他に本発明の分離精製方法に は、 硫安分画法や有機溶媒法も利用し得る。 また、 第 3の主要過程後に例えばセファテックス G 150 などを 用いたゲルろ過法及び DNA セルロースなどを用いたァ フ ィニティークロマ トグラフィーによる精製過程を更 に組合せても良い。 ' - 次に、 本発明の分離精製方法の代表例を示す。 ま ず、 DNAポリメラーゼを生産させた宿主細胞を、 TME ( 50mM TrisH pH7.6 、 lOraM MgC^ 2 、 ImM EDTA ) で洗浄した後、 大量にス ト ッ クする場合、 これを -80 °Cで保存する。
    [0054] 次に、 細胞をその 5倍量の抽出用液体 [ 50raM Tris- HC£、 pH7.6 、 0.1 mM EDTA 、 ImM ジチオスレィ 卜一 ル（DTT) 、 10%グリセリ ン、 0. 5MKCJG 、 ImM フエニル メチルスルフォニルフロラィ ド （PMSF) ] に懸濁し、 こ の溶液に超音波を 1分間かけ、 細胞を破壊し、 更に遠 心分離 （ 12000xg 、 20分間） で処理し沈殿物を除去 し、 細胞の粗抽出液を得る。 なお、 この粗抽出液の調製には、 リゾチーム及び/ または中性の界面活性剤を用いる方法も好適であり、 その他各種の方法を利用しても良い。
    [0055] 次に、 粗抽出液に、 PG溶液 （50mM Tris-HC 、 H 7.6 、 0. 1 mM EDTA 、 ImM DTT 、 10%グリセリ ン） を 加えて 1.5 倍程度に希釈する。 この希釈は、 以後の D E A Eセルロースカラムによる処理が良好に行なえ る程度とすれば.良い。
    [0056] 希釈した粗抽出液の KC 濃度を 0. 4Mに調整してか ら、 これを D E A Eセルロース （フアルマシア社製） を詰た力ラムに通し、 希駅粗抽出液中に含まれる核酸 成分を、 D E A Eセルロースに吸着させて、 該希釈粗 抽出液から除去する。 '
    [0057] カラムに未吸着であった画分 （ DNAポリメラーゼを 含む） に、 上記組成の P C溶液を加えて 2〜 3に希釈 し、 更に KC 濃度を 0.2Mに調整する。
    [0058] 次に、 リ ン酸セルロース （シグマ社製） を詰たカラ ムを 0.2M を含む PC溶液で処理してリ ン酸セル ロースを平衡化した後、 上記のようにして得た調製溶 液を、 これに通し、 更に 0.2M KCJGを含む PC溶液で力 ラムを十分に洗浄する。
    [0059] この操作で、 本発明の DMポリメラーゼをコードす る DNA 配列由来の DNAポリメラーゼの大部分はカラム に吸着する。 なお、 この段階で、 宿主細胞に由来する DNAポ リ メ ラーゼはカ ラムに未吸着と なる ため、 溶出 して しまい、 所望の DNAポ リ メ ラ一ゼと分離する こ と ができ る。
    [0060] カ ラム内に吸着した蛋白質は、 0.2 〜0.7 M KC の 直線濃度勾配を用いて溶出させる こ とができ、 約 0- 4 M KC£付近で DNAポ リ メ ラーゼ活性の単一ピークを得 る こ とができ る。 そこで、 この DNAポ リ メ ラーゼ活性 の高い画分を集め、 これを上記組成の PC溶液で希釈 し、 更にその KC 濃度を 0.15M に、 またグリ セ リ ン濃 度を 20%に調整する。
    [0061] 次に、 この調製溶液を、 リ ッ トマン （ Litman, R. N. , J. Biol. Chem. , 243 , 6222〜 6233, 19ΰ9 ) の方法 C従つ て変性仔牛胸腺 DNA (ワシン ト ン社製） を用いて作成 した DNA セルロースカラムに通す。 更に、 カラムを、 前述の PC溶液で十分に洗浄した後、 0.6〜0.7 M KC^ -PC溶液 （ 20容量％グ リ セ リ ン） を用い、 吸着した DNA ポ .リ メ ラーゼをカ ラ ムか ら溶出させる。 この と き、 DNAポ リ メ ラーゼ活性と蛋白質の一致した単一 ピークを得る こ とができ、 この単一ピークのある画分 を回収し、 DNAポ リ メ ラーゼの精製品を得る こ とがで きる。 この精製品を安定に保存するためには、 グリ セ リ ンを 50%と なる よ う に加えて - 20 °Cに保つのが良 い。
    [0062] なお、 得られた精製品は必要に応じて更に以下のよ う なゲルろ過法およびァフ ィ ニティ ークロマ 卜グラ フ ィ一を組合せ'た過程で処理しても良い。
    [0063] 例えば、 セフアデックス G 150を詰めたカラムを作 成し、 これを 0. 15M KC£ -PC 溶液で平衡化した後、 上 記の第 3の主要過程後に得られた精製品を力ラムにの せ、 これを 0. 15M KCJG -PC 溶液で溶出させ、 溶出液を 分取し、 各画分の DNA ポリメラ一ゼ活性を測定する。 次に、 高い DNA ポリメラ一ゼ活性を示す画分を集めこ れを DNA セルロースカ ラムにかける。 更に、 0. 15M KC£ -PC 溶液で充分洗浄した後、 カラムに吸着した成 分を 15m の 0.15-0.7M KCJG直線濃度勾配 （PC溶液中） を用いて溶出させ、 -高い DNA ポ リ メ ラーゼ活性を示 す画分を集めこれを精製品とする。 なお、 DNA ポ リ メ ラ一ゼを約 0. 4 M KC 濃度で溶出するこ とができ る。
    [0064] このよう にして得られる精製品は、 均一な DNAポリ メ ラーゼを含み、 天然のものと同様の酵素活性を有 し、 かつその比活性は天然のものと同様に十分高いも のである。 .
    [0065] 以下、 実施例 従って本発明を更に詳細に説明する が、 本発明はこれらに限定されるものではなく、 種々 の-態様を取り得る。
    [0066] 実施例 1
    [0067] (第 1 図に示した工程に従ったラッ ト ρο - 13発現用 プラスミ ドの作製）
    [0068] (1) ラ、ソ 卜 po - /3構造遺伝子の前半部分の調製 [第 1 図に （a) で示した工程]
    [0069] まず、 A. Matsukage らの方法（Proc. Nat 1 · Acad. Sc i . USA, Vol.83, pp.5106, July 1986 ) に従って得たラ ッ 卜 po-G - i3の N-末端側半分をコードする DNA 配列 （閧始 コ ドンから 9塩基、 すなわち 3アミノ酸残基に相当す る欠損部分を有する） を含む cDNAを有するプラスミ ド 9-1(^の 10 8 を制限酵素 EcoR I で切断した。
    [0070] なお、 本実施例で用いた制限酵素、 T4 リガーゼ及 び Τ4 キナーゼはいずれも日本ジーン社製のものであ り、 これらを用いた反応は特に指示されていない場合 はすべて常法に従って行なった。
    [0071] また、 該プラスミ ドにおける上記のラ ヅ 卜 ρο - β の Ν-末端側半分をコードする DNA 配列における欠損部 分は、 先に述べたよう な過程を経て本発明者らによつ て特定されたものである。
    [0072] 次に、 反応が終了したところで、 反応液を 0.6%低ゲ ル化温度ァガロースゲル （BRL 社製、 LMP ァガロース ) 電気泳動にかけて DNA 断片混合物から 440 bpのフラ グメ ン 卜 を分離した後、 この 440 bpのフラグメ ン ト含 むゲル部分を切出し、 これをプラスチックチューブ内 に移して 65 に加熱して融解させたところで、 チュー ブ内にその容積の 1/3 程度の TE緩衝液 （ lQmM Tris- HCJ2、 PH 8.0、 lmM EDTA) 飽和フエノールを加えてよ ぐ振り、 更に 12, OOOrpm 、 5 分の遠心分離で処理して 水相を得た。 この得られた水相から 3回のエーテル処 理によって残留のフエノールを取り除き、 更にエタ ノール沈據によって DM を回収した。
    [0073] これとは別に、 UC 118 ベクター （宝酒造社製） の 3 j g を制限酵素 EGOR I で完全に切断し、 アルカ リ フ ォスファターゼ （ベリ ンガーマンハイ ム社製） で処 理しておいた。
    [0074] 次に、 EcoR Iで切断した線状 pUC 118 の l g と先 に回収した 440 bpの DNA フラグメ ン 卜 とを、 T4 リ ガーゼ （500単位) の存在下で室温で 2時間反応させ た。
    [0075] 反応終了後、 反応物の一部をカルシゥム法によって 大腸菌 MV1304株 （宝酒造社製） に導入し、 これを以下 の組成のい broth で培養した後、 形質転換株をアンピ シリ ン （ 50 g /m£ ) プレート [L-broth に 1.5%の寒 天 （バク 卜ァガー、 ディ フコ社製） を加え、 これにァ ンピシリ ン （明治製菓製） を加えて調整したもの] で 選別した。
    [0076] し- broth 組成 ；
    [0077] パク 卜 卜 リブト ン （ディ フコネ土製） 10g ィース十エキス トラク ト （ディ フコ社製） 5g
    [0078] ブド ゥ糖 lg 水 1 Ά
    [0079] アン ピシ リ ン耐性を示したコ ロニーから 12のコロ ニーを選別し、 これらを個々に i.5m の上記組成のい broth で振と う培養し、 培養細胞からミニライセ一 卜 を調製し、 それを制限酵素 Hindm及び Xh。 I とで切断 したものと、 Hindm及び Bg_C IIで切断したものの両方 を作成し、 これらを個々 に 1¾ァガロース電気泳動にか けて、 形質転換株中に含まれるプラスミ ドの構成を検 討した。
    [0080] その結果から、 第 2.図に示すよう にプラスミ ド PUC9 -10F由来のラ ッ 卜 poJ2 - 13遣伝子の一部を含む DNA フ ラグメン ト （ 440 bp) が、 0 - ガラク トシダーゼ （ |3 - ga^ ) 遺伝子と同方向に挿入されているブラスミ ド を含む 3つのコロニー （# 7 、 # 8、 # 9 ) を選別し た。
    [0081] (2) 一本鎖 DNA の調製
    [0082] 上記（1) 項で選別した 3つのコロニー # 7 、 # 8 、 # 9を個々に、 以下の組成の 2XYT培地にアンピシリ ン を 50μ g /m の割合で加えた培地で振と う培養し、 そ れぞれの培養において、 0De o o =0. 1程度の菌体濃度 が得られたと ころで、 それぞれの培養液に 1 X 109 p. f. uのヘルパーフ ァージ M13K07 (宝酒造社製） を加 え、 更に 1晚振とう培養を続けた。
    [0083] 2XYT培地組成 ；
    [0084] バク 卜 卜 リプトン （ディ フコ社製） 32g ィース 卜エキス 卜ラク 卜 （ディ フユ社製） 20g
    [0085] NaC-β 10g 水 - 1 Ά 培養終了後、 各培養液から遠心分離 （12, 00Qrpm 、 10分間） によって菌体を除き、 得られた各上清に
    [0086] NaC^ 0.3 g及びポリエチレングリ コール 6000 (商品 名、 和光純薬社製） 0: 2gを加え、 4 °Cで 2時間放置 し、 ファ一ジ粒子を凝集させた。
    [0087] 次に、 各上清中で凝集したファージ粒子を遠心分離
    [0088] ( 12, 000rpm 10分間） によって集め、 それぞれ 300 μ の TE緩衝液に懸濁した後、 この懸濁液の各々に 200 μ _Gのフェノール ： クロロフオルム混液 （ 1 ： 1 ) を加え、 よく振って脱タンパク処理を行ない、 更に エーテル処理を 3回行ない、 懸濁液中から残留フ エ ノールを除き、 最後にエタノール沈殿処理により、 精 製物を得た。 なお、 この精製物の収量は、 各懸濁液で 4.5 μ g であつた。
    [0089] この精製物をァガロースゲル電気泳動にかけたとこ ろ、 前記第 （1) 項で得たプラスミ ド PUC9-10F由来の ラ ッ 卜 po^ - j3遺伝子の一部を含む DNA フラグメ ン ト ( 440 bp) が、 /3 - ガラク 卜シダーゼ （ /3 - ga£ ) 遺 伝子と同方向に揷入されているプラスミ ドの片方の鎖 からなる一本鎖 DNA であることが確認された。
    [0090] (3) オリ ゴデォキシヌクレオチ ドを用いた突然変 異誘発 [第 1 図に （b) で示した工程]
    [0091] 上記（2) 項で得た一本鎖 DNA は、 前記（1) 項で得た 440 bp の DNA フラグメン トのラ ヅ 卜 po - & の N-末 端側半分をコー ドする DNA 配列の閧始コ ドンから 9塩 基、 すなわち 3アミノ酸残基に相当する欠損部分をそ のま.ま有している。 - そこで、 この欠損部分を以下のよ う にして補塡し た。
    [0092] まず、 第 3図（c) に示すような上記の欠損部分に相 当する DNA 配列 （ 2重波線で示された部分） と、 該欠 損部分に相当する DNA 配列の 3 ' 側に位置し、 /3 - ga 遺伝子の閧始コ ドンより上流の部分と相補性を示 す DNA 配列と、 該欠損部分に相当する DNA 配列の 5 ' 側に位置し、 ラッ 卜 po£ - 13遺伝子の上記欠損部分 （ 開始コ ドンを含む 9塩基からなる） よ り下流の部分と なる最初の 11塩基と相補性を示す DNA 配列とからなる オリ ゴデォキシヌクレオチド （30塩基） を、 日本ゼォ ン genet を用いて合成した。 次に、 このオリ ゴデォキシヌクレオチ ドの 5 ' 側を リ ン酸化した。 このリ ン酸化は、 35ngのオ リ ゴデォキ シヌク レオチド と T4 キナーゼ （ベ一リ ンガーマン八 ィム社製） 16単位とを 50tnM tris-HC 、 H 7.9, 6mM MgCjS 2 、 10 mM j3 - メルカプトエタノール、 5mM ATP を含む水溶液中 （10μ ·β ) で反応させ （37°C、 30 分間） 、 10Q 。C、 30秒の熱処理によって T4 キナーゼ を失活させて反応を終了させる こ とによって行なつ た。
    [0093] 反応終了後、 反応液の 2" J2 (リ ン酸化オリ ゴデォ キシヌクレオチドを 7 ng含む） と、 前記（2) 項で得た コロニー # 8由来の一本鎖 の 0.9 μ § を含む上述 組成の ΤΕ緩衝液 2μ Ά とを混合し、 更にこれにァニー ル用緩衝液を加えて全体を 1 Q At ·β と し、 これをキヤ ビラ リ 一に封入した。 なお、 ァニール用緩衝液の組 成 （最終濃度） は、 30mMTris _H C JG 、 pH 7.9、 6raM MgC £ 2 、 120mM NaC 、 1 OmM - メゾレカプトエタ ノールであった。
    [0094] 次に、 キ ヤ ビラ リ 一に封入した反応液をまず 100 °C、 1分間の条件で加熱処理し、 次に、 温度を 60Όに 低下させてから、 3時間かけて 28でまで除冷した。
    [0095] 更に、 キヤ ピラ リーを開封し、 反応液を取出し、 こ れに lOraM dATP 、 dGTP、 dCTP、 TTP を含む水溶液 （吉 富製薬製） の 0.8 Ά、 lOraM ATPを含む水溶液 （シグ マ社製） の 0.8 μ Q , 4 単位のクレノ ウ酵素 （ベーリ ンガーマンノ、ィム社製） 及び 5000単位の Τ4 リガ一ゼ を加え、 28°Cで 2時間これらを反応させた。
    [0096] 反応は、 反応液にフ ノール- クロ口ホルム混液 （ 1 ： 1 ) を加えるこ とによって終了させた。
    [0097] 反応終了後、 反応液のエーテル処理を 3回行ない、 その一部を大腸菌 HB1Q1 ( UCLA分子生物学研究所 Dr. Dan S Ray よ り入手） に塩化カルシウム法によって導 入した。
    [0098] なお、 以上の操作を前記（2) .項で得たコロニー # 8 由来の一本鎖 DNA の代り にコロニー # 9由来の一本鎖 DNA を用いて同様にして用いて行ない、 最終的に得ら れた反応液を大腸菌 HB101 に塩化カルシウ ム法によつ て導入した。
    [0099] (4) 組み換え体の検出
    [0100] 前記（3) 項で反応液を導入した 2種の大腸菌 HB101 を、 個々に前記い broth 培地で培養し、 更に、 前記項 で用いたアンピシリ ンプレー卜でアンピシリ ン耐性を 示すコロニーを選別した。
    [0101] 次に選別した各コロニーのうち、 所望とするラ ヅ ト po^ - |3の N-末端側半分をコードする DNA 配列を含む プラスミ ドを有するものを、 以下に示すコロニーハイ ブリダィゼーシヨ ン法によって選別した。 すなわち、 まずフィルター （ミ リポア社製、 HAタイ プ、 ひ.45μ πι 、 直径 82mm) をアンピシリ ンプレー卜上 に置き、 プレー卜上のコロニーから菌体をフィルター 上に移し取り、 各コロニーからの菌体が吸着した面を 上にしつつ、 以下に示す溶液をしみ込ませたろ紙上に 所定時間置いた。
    [0102] 1) 0.5 N NaOHで 7分間
    [0103] 2.) 0.5 M Trs-HCjg pH7.4 で 2分間
    [0104] 3) 0.5 M Trs-HC>G、 pH7.4 で更に 2分間
    [0105] 4) 1.5M NaCjgを含む0.5 ¾ 1>3-11(： 、 pH7.4 で 5分間
    [0106] 次に、 4)の溶液 5 & in をフィルタ一に通し、 更に 50 m のクロ口ホルムをフィルターに通した後、 フィル タ一を乾燥させ、 更に 80°C、 1.5 時間、 真空中でのベ ィキングを行ない、 DNA を固定した。
    [0107] DNA を固定したフ ィ ノレ夕 は、 X 10 Denhardt 液 ( X I Denhardt 液 ： 0.02¾ ポリ ビュルピロ リ ドン、 0.02% Flcoll 400、 0.02¾ 牛血清アルブミ ン） 、 100 μ ^ /mjGの変性サケ精子 DNA 、 X 4 SSC ( X 1 SSC ： 0.15M 塩化ナ卜 リ ゥム、 0.015Mクェン酸三ナ ト リ ウ ム、 塩酸で pH 7.4に調整） 及び 0.5¾Triton X-100に浸 し、 65°G、 2時間のプレ八イブリダィゼーシヨ ンを行 なった後、 液を抜取り、 更に、 （32P-y ) ATP 10μ Ci で標識した前記（3) 項で用いたォリゴデォキシヌクレ ォチ ド と同様の塩基配列を有するプローブと しての合 成オ リ ゴデォキシヌク レオチド 30ngを含む X 4 SSC 、 X 10 Denhardt 液、 0.5¾Triton X-100 (総量 2 Q ) に浸し、 58° (：、 10時間のノイブリダィ ゼ一シ ヨ ンを行 なった。
    [0108] 反応終了後、 フ イ ノレタ ー に 60 m の 50 ° ( 、 X I SCC 、 5分間の洗浄処理を 3回行なっ た後、 乾燥さ せ、 X線フ ィルム （富士デンタルパノ ラマ NIFタイプ ) に露出した。
    [0109] その結果、 # 8由来の反応液を導入したコロニーで ア ンピシリ ン耐性を示したもののうち、 約 15%が、 ま た # 9由来の反応液を導入したコロニーでアンピシリ ン耐性を^したもののう ち、 約 30%がプローブに強く 結合する DNA を有していることが判明した。
    [0110] こ こでポジティ ブな反応を示した DNA の起源となつ たコロニーには、 なお変異型 （前記欠損部分が補われ たもの） と ともに非変異型 （前記欠損部分が補われて いないもの） が残存している可能性があるので、 ポジ ティ ブな反応を示した DNA の起源となったコロニーに 変異型があるのを確かめた上、 該コロニーからプラス ミ ドを分離して、 それにを再度大腸菌に導入し、 変異 型のみを持つ株を選択する必要がある。
    [0111] そこで、 # 8由来の反応液を導入したコロニーでァ ン ピシ リ ン耐性を示し、 かつポジティ ブな反応を示し たものから 9個、 # 9 由来の反応液を導入したコロ 二一でアンピシリン耐性を示し、 かつポジティブな反 応を示したものから 4個のコロニーを選択し、 それぞ れをし 5mjGの前述のい brotti で 14時間、 振と う培養 し、 それぞれからミニライセー ト を常法によ り調製 し、 それぞれ EcoR Iで切断し、 1¾ァガロース電気泳動 にかけた。
    [0112] なお、 これに際しては、 第 1図に（b) で表した過程 前後のプラスミ ドの構成に示されているよう に EcoR I 切断部位 （ R I ) が 2 ケ所あるが、 変異型ではそれが 1 ケ所に減っているので、 これらを容易に検出でき る。
    [0113] 変異型を比較的多く含む # 8由来の反 )S液を導入し ' たコロニー （# 8-2 、 # 8-7 ) 及び # 9由来の反応液 を導入したコロニー （ # 9-12 )を選別し、 それらから 常法に従って得た各ミニライセー卜を次に、 大腸菌 JM 109 株 （宝酒造社製） に個々に導入して、 それらを培 養し、 その中から形質転換株をアンピシリ ンプレー卜 上で選択した。
    [0114] 得られた形質転換株 # 8-7-7 及び # 9-12-16 を 300πι5の前述のい broth で大量に培養し、 得られた菌 体から DM を精製した （# 8-7-7 から 120 μ g 、 # 9- 12-16 から 60μ g ) 。
    [0115] この精製 DNA を、 制限酵素処理して、 その制限酵素 地図を作り解析したと ころ、 リ( 118の ac遺伝子のプ 口モータ—と オペ レーター、 シャ イ ン . ダルガーノ
    [0116] (SD)配列 （ リボゾーム結合部位） の下流に、 外来遺伝 子であるラ ッ 卜 po£ - 13遺伝子の前半部分 （開始コ ド ンから構造遺伝子のほぼ中央の EcoR I切断部位までを 含む） を ac遺伝子の最初の遺伝子 （ /3 - ガラク ト シ ダーゼ遺伝子） の開始コ ド ンに合せて挿入したプラス ミ ドが含まれていることが確認された。
    [0117] (5) PUC9-10Sフ ラグメ ン トの導入
    [0118] [第 1 図（c) で示した工程]
    [0119] 前記（4) '項で得た # 8-7-7 及び # 9-12-16 から得た 精製 DNA の各々 1 x g を制限酵素 EcoR I で切断し、 更 にフ ォスフ ァターゼ処理を行なった。
    [0120] 次に、 前記（1) 項に引用した松影 （本発明者らの一 人） 及び Zmudzka らの文献に記載の方法によ り p UC9 -10Sを調製し、 これから前記（1) 項で述べたと同様の 手順で、 PUC9-10Sの EcoR I 切断フ ラグメ ン ト （ 770 bp、 ラ ッ 卜 ρο£ - 0の C一末端側半分をコー ドする第 1 図で Sで示された DNA 断片） の 0.2 μ. g を得た。 こ こ で、 先にフ ォ スフ ァ ターゼ処理した精製 DNA と、 上記フラグメン ト （770 bp) を、 前記（1) 項と同 様の手順で、 T4 リガーゼにより連結した。
    [0121] 得られた反応物のそれぞれを、 大腸菌 JM 109株 （宝 酒造社製） に導入し、 これを培養してから、 アンピシ リ ンプレー卜上で形質転換株を選択した。
    [0122] ァンピシリ ン耐性を示したコロニーからそれぞれ 12 個ずつ計 24個を採取し、 それぞれを前述のい broth ( 1.5m£ ) で培養し、 常法に従って各培養菌体からミニ ライセ一卜を調製した。 得られた各ミニライセ一卜を EcoR I で切断し、 前記（1) 項と同様の方法によって PUC9-10Sの EcoR I切断フラグメ.ン ト （77Q bp) の有無 を調べた。
    [0123] その結果をもとに、 フラグメン ト （770 bp) を有す るコロニーを、 # 8-7-7 由来の D A を用いて調製され た反応物で形質転換されたコ口ニーから 6個、 # 9-12 ' -16 由来の DNA を用いて調製された反応物で形質転換 されたコロニーから 6個取り出し、 それぞれを更に上 記と同様にして培養した後、 各培養菌体からミニライ セ一トを調製して、 前記（1) 項と同様の方法でフラグ メン ト （770 bp) の挿入方向を検討した。
    [0124] その結果、 # 8-7-7 由来の DNA を用いて調製された 反応物で形質転換されたコロニーのうちの 4假 （# 8- 7-7-2 、 # 8-7-7-5 〜- 7) に、 また # 9-12-16 由来の DNA を用いで調製された反応物で形質転換されたコ口 ニーのうちの 1つ （# 9-12-16-23) にフラグメン ト （ 770 bp) が、 欠損部分が補われたラ ッ 卜 PO JG - ]3の N一末端側半分をコ一ドする DNA 配列 （第 1 図の（b) の過程を経て得られた Fで示された DNA 断片） の下流 に所望の挿入方向で挿入された組換え体 （第 1 図） 存在することが確認された。
    [0125] (6) 大腸菌を宿主と したラッ 卜 Ρ0·β - |3 の発現
    [0126] 前記（5) 項で得た所望の組み換え体を含む株 # 8-7- 7-2 、 # 8-7-7-5 〜- 7及び # 9-12-16 -23のそれぞれを 1. 5 πΐ·β のアン ピシ リ ン （ 50 μ /ηΐ·β ) を含む前述の 2ΧΥΤ培地で培養し、 OD6。0 = 0.2 程度の菌体濃度が得 られたと ころで、 各培養液に 0.1M IPTG (イソプロピ ル 0 - D - チォガラク ト ピラノサイ ド、 シグマ社製） を 15μ ^加えい更に 1 晚振とう培養を続けた。
    [0127] 得られた各培養液 （菌体を含む） の 200 μ ·β に、 50 % TCA ( ト リ クロ口酢酸） の 22μ ·βを加えてから、 こ れを 15, OOOrpm 、 3分間の遠心分離処理し、 上清を除 去して、 更に沈殿物に約 0.5m のアセ ト ンを加え、 遠 心分離 （ 15, OOOrpm 、 3分間） にかけ、 上清を除去し て沈殿物中の残留 TCA を取り除いた。
    [0128] 得られた各沈殿物の 30μ £を、 0.0625Μ Tris- HCJG 5 % β - メルカプトエタノール、 2¾SDS 、 10%グリ セロール、 0.1 %ブロモフエノールブルーからなる溶 液に溶かし、 その半分を SDS ゲル電気泳動による解析 に用いた。
    [0129] その結果、 これらの形質転換株から 40KDa の蛋白質 の生産が確認された。
    [0130] なお'、 前記（5) 項で得られたフラグメン ト （ 77ひ bp ) が逆方向に揷入されたプラスミ ドを含むコロニーを 上記と同様の操作によって培養し、 その培養液を処理 して蛋白質の解析を行なったところ、 SDS ゲル電気泳 動では、 宿主由来の極薄いバン ド しか認められなかつ た。
    [0131] 更に、 40KDa 蛋白質の生産の経時的変化を調べてみ たところ、 IPTGの添加による誘導後、 約 6時間でほぼ 最高の生産が行なわれることが確認された。
    [0132] また、 IPTGの添加の有無による細胞増殖速度につい て検討したところ、 これらにはほとんど差はなく、 生 産された 40KDa 蛋'白質が細胞に無害であることが確認 ざれた。
    [0133] このよう にして得た 40KDa 蛋白質を生産する形質転 換株のうちからその生産量の多い 2つの株 （ # 8-7-7- 5 、 # 8-7-7-6 ) を選択し、 それらを個々 に培養し て、 各培養菌体から常法によ り プラスミ ドを調製し た。 これらのプラスミ ドの DNA 配列について、 マキサ ム ギルバー 卜法によって解析した結果、 ρϋΠ18の ac遺伝子のプロモーターとオペレーター、 シャイ ン • ダルガーノ配列 (リポゾーム結合部位） の下流で、 3 - ガラク 卜シダーゼ遺伝子の開始コ ドンが存在して いた位置から、 ラ ヅ 卜 PO J2 - /3をコードする第 4 A図 〜第 4 D 図に示すよ う な塩基配列の構造遺伝子 [ 1008 bp (終止コ ドン 1 つを含む） からなり、 335 個 のアミノ酸残基からなる配列を有するラ 、ソ 卜 Ρθ·β _ β をコー ドする ] がその開始コ ドンから挿入されたブラ スミ ドを有していることが判明した。
    [0134] これらのプラスミ ドをそれぞれ pUC118po - β -5, 及び pUC118po - j3 -6と命名した。
    [0135] 実施例 2
    [0136] (組換え体 pUC118po_C - ί -5を用いたラ ッ ト ρο·β - β の生産とその精製）
    [0137] (1) 組み換え体 pUC118p0Je - 0 -5を導入した形質転換 株の培養 '
    [0138] 実施例 1 の （6) 項で得た形質転換株 # 8-7-7-5 ( JMp β 5 ) を、 50 g /n ^のアンピシ リ ンを含む実施 例 1 で用いた 2XYT培地 1 中で 37°Cの条件で振と う培 養した。
    [0139] なお、 この形質転換株 JMp)3 5 は、 昭和 62年（1987 年） 11月 30日付けで、 ブタペス ト条約に基づいて通商 産業省工業技術院微生物工業技術研究所 （日本国茨城 県つく ば市東 1丁目 1 番 3号、 郵便番号 305 ) に寄託 され、 該寄託菌株の原寄託曰は昭和 62年（1987 年） 11 月 30曰であり、 受託番号は F E R M B P — 1 5 8 2 号である。 600nm の吸光分析で吸光度が 0.5 程度であるような 菌体濃度が得られたと ころで、 培養筏を 2分し、 一方 に IPTGを 0.5mM の濃度となるように加え、 更にこれら - を 7時間培養した。
    [0140] 培養終了後菌体を遠心分離によって集菌した。 得ら れた菌体量はと もに約 3gZ 1 Ά培養液であった。 このよう にして得た菌体を個々に 1 % SDS 、 5¾2-メ ルカプ卜エタノールを含む SDS ゲル電気泳動用サンプ ル液に懸濁し、 100 °C 2分間加熱処理して、 完全に 可溶化した後、 これを SDS-ポリアク リルアミ ド電気泳 動にかけた。
    [0141] - . その結'果、 IPTGの添加、 無添加の両方において、 40 KDaのポリペプチドが大量に検出され、 また IPTGを添 加した方がその量が多かった。 この IPTG添加培養で得 られた菌体の全蛋白質量に対する 40KDa のポリベプチ ドの割合を調べたと ころ、 全蛋白質の 19.3%に達し - た。 なお、 場合によっては菌体が成長飽和 （定常） 状 態に達した場合、 IPTGを加えなくても最大この 19.3% 近くの ρο - の生産が行なわれた。
    [0142] この 40KD aのポリペプチドのサイズは、 ラッ トや二 ヮ ト リ等の po £ - /3 と一致していた。
    [0143] なお、 参考のため、 実施例 1 の （1) 項に引用した Zmudzka らの方法によって得た、 POJG - /3構造遺伝子 に前逑の欠損部分を有するプラスミ ドを大腸菌《ΙΜ109 に導入し、 形質転換株 JM Ρ 2-1 を得、 それを上記と 同様に して培養し、 得られた菌体の蛋白質を分析し た。
    [0144] その結果、 上記 JMp j3 5 の培養で認められたよう な 40KDa のポリペプチ ドは見い出されなかった。
    [0145] これとは別に、 大腸菌 JM109 を上記と同様にして培 養し、 得られた菌体の蛋白質を分析した。
    [0146] その結果、 この培養においても上記 JMp |3 5 の培養 で認められたよう な 40KDa のポリぺプチ ドは見い出さ れなかつた。
    [0147] (2) 菌体抽出.液の調製と .、'該抽出液中の Ρθ·β - 3活性 の測定
    [0148] 上記（1) で得た菌体のそれぞれを個々 に以下のよう にして処理した。
    [0149] まず、 菌体を、 TME (10mM MgC^ 2 、 ImM EDTA、 を含 む 50mM Tnis-HC JG緩衝液、 pH7.6 ) で洗浄した後、 -80 °Cで保存した。
    [0150] 次に、 菌体の 5倍量の抽出用液体 [ 50mM Tris- HC^ 、 pH7.6 、 0. 1 raM EDTA 、 Ira ジチオスレィ 卜一 ル（DTT) 、 10%グリ セ リ ン、 0.5M KC 、 ImM フ エ二 ルメ チルスルフ ォニルフ 口才ライ ド （PMSF) ] に懸濁 し、 この溶液に超音波を 1分間かけ、 細胞を破壊し、 更に遠心分離 （ 1200Q X g 、 20分間） で処理し沈殿物 を除去し、 細胞の粗抽出液を得た。
    [0151] 次に、 得られた 2種の粗抽出液の Ρ0 - β活性を、 山口 （本発明者らの一人） らの方法 （ J. Biol. Chem. 255 、 9942〜9948、 1980年） により測定した。 なお、 ここでの 1単位の活性は、 1時間に lnmo4の dNTPを重 合させる酵素量として定義した。
    [0152] その結果を表 1 に示す。 なお、 参考のため前記（1) で培養した《ίΜρ ί 2-1 と大腸菌 JM109 を甩いて上記と 同様にして粗抽出液を調製して、 その Ρ0 - 13の活性 を測定した （表 1 ) 。
    [0153] 表 1
    [0154] この結杲、 IPTGで誘導した JMp 35 で特に高い活性 が得られ、 それは JM109 の約 20倍に達した。
    [0155] なお、 JM109 の活性の大部分は、 DNAポリメラーゼ I と考えられる。 JMp /3 5 の比活性を 40KDa ポリペプチ ド当り に換算 する と、 6 X 105 単位ノ mg蛋白質となった。
    [0156] (3) 粗抽出液からの ρο - |3の精製とその性質の検定 前記（2) 項で得た JMp |3 5 の培養から得た 2種の粗 抽出液をそれぞれ個々 に用いて以下の処理を行なつ た。
    [0157] まず、 粗抽出液に、 PC溶液 （ 0. 1 mM EDTA 、 ImM DTT、 10%グリセリ ンを含む 50mM Tris-HC 緩衝液、 pH 7.6 ) を加えて 1.5 倍程度に希釈した。
    [0158] 希釈した粗抽.出液の KC^濃度を 0. 4Mに調整してか ら、 これを DEAEセルロース （フアルマシア社製） を詰 たカ ラ ムに通し、 希釈粗抽出液中に含まれる核酸成分 を、 DEAEセルロースに吸着させて、 該希釈粗抽出液か ら除去した。
    [0159] カ ラ ムに未吸着であった画分 （ラッ 卜 po - β を含 む） に、 上記組成の P C溶液を加えて 2〜 3倍に希釈 し、 更に KC JS濃度を 0.2Μに調整した。
    [0160] 次に、 リ ン酸セルロース （シグマ社製） を詰たカラ ムを 0.2M KC JG を含む PC溶液で処理して リ ン酸セル ロースを平衡化した後、 上記のようにして得た調整溶 液を、 これに通し、 更に 0.2M KC£を含む PC溶液で力 ラ ムを十分に洗浄した。 この操作で、 本発明のラ ッ 卜 po^ - <3 ポリメ ラーゼの大部分はカ ラ ムに吸着した。 なお、 この段階 で、 宿主細胞に由来する DNAボリメラーゼ I等はカラ 厶に未吸着となるため、 溶出してしまい、 これらと所 望のラ ッ 卜 po - と分離することができた。
    [0161] カラム内に吸着した蛋白質は、 0.2 〜0.7 M KC£ 0 直線濃度勾配を用いて溶出させることができ、 約 4M
    [0162] KC^付近でラ ッ 卜 po£ - 13活性の単一ピークを得 た。 そこで、 このラ ヅ ト po_C - 活性の高い画分を集 め、 これを上記組成の PC溶液で希釈し、 更にその KC 濃度を 0.15M に、 またグリセリン濃度を 20%に調整し た。 '
    [0163] 次に、 この調整溶液を、 変性仔牛胸腺 DNA (ヮシン 卜ン社製) を用い、 前述のリ ヅ 卜マンの方法に従って 作成した DNA セルロースカラムに通した。 カラムを、
    [0164] PC溶液で十分に洗浄した後、 0.6MKCJ2 -PC溶液 （20% グリセリン） を用い、 吸着したラヅ ト po - ]3をカラ ムから溶出させた。 このとき、 ラ ヅ 卜 ρο·β - /3活性と 蛋白質の一致した単一ピークを得ることができ、 この 単一ピークのある画分を回収して、 DNA ポリメラーゼ の精製品を得ることができた。
    [0165] 以上の精製操作の各段階における含有蛋白質を 10% ゲゾレと Laeramli, ϋ. Κ. , Nature.227 , & 8ひ〜 685, 1970) の 溶媒系 （ 卜 リス緩衝液） を用いた SDS ポリ ァク リルァ ミ ド電気泳動で追跡したと ころ、 粗抽出液段階では 40 KDa に相当するバン ドを含む主要な 6個の濃いバン ド が、 DSAEセルロース処理段階では 40KDa に相当するバ ン ドを含む主要な 6個の濃いバン ドが、 リ ン酸セル ロースでの処理段階では 40KDa に相当する濃い単一の バン ドが、 DNA セルロースでの処理段階では 40KDa に 相当する濃い単一のバ ン ドがそれぞれ得られた。 な お、 この結果は 2種の粗抽出液の両方の場合について 同じであった。
    [0166] また、 最終的に得られた各精製品は、 ポリ アク リル アミ ド電気泳動で単一のバン ド （40KDa ) を示し、 そ の po - |3比活性を前記（2) 項に記載の方法によって 測定したところ、 7.5 X 105 単位/ mgであった。
    [0167] 一方、 セフアデッ クス G 150を詰めたカラム （ 1.5 X 50cm) を作成し、 これを 0.15M KC£ -PC 溶液で平衡 ィ匕した後、 先の DNA セルロースカラムによる処理後に 得られた精製品 （ 0.7 M KCJG -PC溶液で溶出させた画 分） をカラムにのせ、 これを O. i 5M KC^ -PC 溶液で溶 出させ、 溶出液を分取し、 各画分の po - 13活性を測 定した。 次に、 高い po - 0活性を示す画分を集めこ れを更に DNA セルロースカラム （ 0.6 X 5cm) にか け、 0.15M KC£ -PC 溶液で充分洗浄した後、 カラムに 吸着した成分を 15m の 0.15-0.7M KC£直線濃度勾配 （ PC溶液中） を用いて溶出させ、 高い po_G - /3活性を示 す画分を集めこれを精製品とした。 なお、 13は 約 0.4 M KCJ2濃度で溶出された- このよう にして得ら れた精製品における - (3の純度は 98〜99%と非常 に高いものであった。
    [0168] なお、 ラッ ト細胞から直接抽出精製した P0 - (3 と 上記精製品のポリァク リルアミ ド電気泳動の結果を比 較したところ、 ともに 40KDa のサイズを有し、 これら に差は認められなかつた。
    [0169] 次に、 ィムノ ウエスタン法によって、 精製品を分析 した。
    [0170] まず、 先に述べた精製品の SDS ポリ アク リルアミ ド 電気泳動で得られた 40 KDaのバン ドに含まれる蛋白質 を、 ブロ ッティ ング装置 （Bio-rad 社製） を用い、 二 卜 ロセルロース膜上に移した。 次に、 25mM ris/ 192mM グリ シン、 H8.3 、 20%メタノールからなるブ ロ ヅ ティ ング溶液中で、 2, 000 V、 15時間のブロ ヅ ティ ングを行なった。
    [0171] 更に、 膜を 20%牛胎児血清を含む TBS (50raM Tris- HC 、 pH8.3 、 150mM NaC jg ) でブロ ッ クした後、 該 膜を 5ひ 0 倍に希釈した抗ニヮ ト リ po - /3 ゥサギ抗体 と室温で 2時間反応させ、 更に 2次抗体である、 ペル ォキシダーゼ結合抗ゥサギ IgG 抗体 （ャギ） と反応さ せた （室温、 2時間） 。
    [0172] 最後に、 膜を洗浄した後、 0.05% 4-クロルナフ 卜一 ル、 0. (H5¾の H 202、 16.5%のメタノールを含む TBS に つけ、 発色反応によ り 抗原ポ リ ペプチ ド を同.定し た。
    [0173] その結果、 精製品から得られたポリペプチ ドは、 抗 二ヮ 卜 リ po_G - 0 ゥサギ抗体と交叉した。
    [0174] 以上の結果から、 得られた精製品は、 ラ ッ 卜 ρο·β _ i3活性を有するものであることが確認された。 また、 更に、 この精製品の酵素活性は天然のものと同様であ り、 その比活性も天然のものと同様十分に高いもので あることが確認された。
    [0175] 次に、 得られた精製品のヌクレアーゼ活性を以下の 方法に従って測定した。
    [0176] まず、 3' ― 5' ェキソヌクレアーゼ活性測定のた め、 プラスミ ド pMl-1 (本発明者らが自製したもの） を制限酵素 Hindin、 Sc_C I で切断し、 ァガロース電気 泳動法で 2347bpの断片を得て、 その 3' - 末端を32 P- dCTPとク レノ ウ酵素を用いて標識した。
    [0177] 次に lOmM Tris-HC^ , ρΗ7.5 、 7mM MgC£ z 、 20m NaC£ , 7raM 2 -メルカプトエタノール、 100 ju g /mJZ ゼラチン、 105 cpm の標識 DNA及び 60〜75単位の精製 品からなる反応液を 50μ 調製し、 37°Cで反応を進行 させた。
    [0178] 反応の進行と ともに経時的にサンプリ ング （ 10μ £ ) して、 0.5 %ァガロースゲル電気泳動とオートラジ ォグラムとで分析し、 標識 DNA 断片からの32 P の減少 によ り 3' → 5' ェキソヌク レアーゼ活性を測定し た。 ：
    [0179] その結果、 精製品においては 3' — 5' ヱキソヌク レア一ゼ活性は認められなかった。
    [0180] なお同様の測定をクレノ ウ酵素を用いて行なったと ころ活性が認められ 。
    [0181] 更に、 精製品のエン ドヌクレアーゼ活性をプラスミ ド PUC19 D の閉璟状 DNA ( I型） が DM 鎖切断によ り開環状 （ Π型） に変換するかどうかによって測定し た。
    [0182] すなわち、 標識 DNA 断片の代りに 2 jLt g の pUC 19 ( 宝酒造社製） DM [80〜90%が （ I型） ] を用い、 ま ' た酵素量を 80〜120 単位とする以外は、 上記ェキソヌ グレア一ゼ活性の測定における反応液と同様の組成の 反応液を調製し、 これを 37°Cに保温して反応を進行さ せ、 経時的にサンプリ ングして、 0.6¾ァガロースゲル 電気泳動にかけ、 ェチジゥムブ口マイ ドで染色し、 I 型の減少及び Π型の増加があるかどうかを追跡し た。
    [0183] その結果、 本実施例で得られ精製品においてはェン ドヌク レアーゼ活性は認められなかった。 また、 同様 の測定をクレノ ウ酵素についても行なったところ同様 に活性は認められなかった。 産業上の利用可能性
    [0184] 本発明によ り ラ ッ 卜等の動物に由来する DNA ポリメ ラーゼの遺伝子工学的手法による宿主細胞中での発現 と、 該 DNA ポリメラ一ゼの純粋な形での大量生産が可 能となる。
    [0185] また、 従来よ り繁用されている大腸菌由来の DNA ポ リメ ラーゼ I ゃク レノ ウ酵素がヌクレア一ゼ活性を持 つのに対して、 本発明により得られた DNA ポリメ ラ一 ゼ |3 にはヌク レアーゼ活性がない。 従って、 本発明 によ り得られた DNA ポリメラ一ゼを用いた DNA 合成で は、 3 ' 末端を完成する こ とができるので、 ヌク レ ァーゼ活性を必要と しない、 あるいはヌク レアーゼ活 性を所望しない DNA 合成に直接使用でき、 かつ純粋な 形で大量生産可能であるので、 DNA ポリ メ ラーゼに対 する拡大しつつある需要に十分対応できる ものであ る。
    [0186] また、 本発明によ り得られた DNA ポリメ ラーゼは、 例えば、
    [0187] a) DNA シークェンシングなどの組換え用と しての、 また
    [0188] fa) DNA 上の任意の場所に突然変異を起させる、 いわ ゆる部位特異的突然変異誘発の際に、 二重鎖を形成さ せる反応用と しての
    [0189] 酵素剤の成分と して有用であるなど、 多目的なタンパ ク工学用に広く使用可能である。
    [0190] 更に、 本発明の DNA ポリメラーゼをコードする DNA 配列を組込んだ DNA ポ リ メ ラーゼ発現用の組換え体 に、 一本鎖 DNA とすることが可能なベクターを用いた 場合、 ただちに部位特異的突然変異部分を含む合成ォ リ ゴヌク レオチドブライマーど結合できるので、 ミス マッチプライマー法によ り 目的とする置換、 挿入、 肖 !1 除等の操作の入つた塩基配列の二重鎖 DNA が得られ、 これを適当な宿主に導入して、 新たな生理活性を有す るタンパク質を更に発現させることが可能となる。
    [0191] また、 本発明によって D A ポリメラーゼが大量に生 産され、 例えばエームステス トとは異なる i n v i troで の変異原性試験に用いる試薬と して有効に利用でき る。
    [0192] なお、 変異原物質による鐯型 DNA に対する相補 DNA の合成の際の読み誤りを、 大腸菌- パクテリオファー ジの系でファージの突然変異として検出するこの試験 法は、 エームステス ト と異なり、 変異のメカニズムを も明らかとすることができる上、 感度が遙かに高いと いう利点がある。 そこで、 本発明は、 このような有用 な試験の普及に今後貢献できるものである。
    [0193] 更に、 本発明によって、 動物疾患の診断薬若しくは 治療剤等の用途における需要に対応する DNA ポリメ ラーゼの大量生産が可能となる。 他方、 現在皮膚でのう つ血に DNA 分解酵素である DNA ァ一ゼ I が効果があり、 実際にその治療に用いら れていることなどから、 逆に種々の疾患の発現機序に DNA 合成酵素である DNA ポリメラ一ゼが関与していた り、 また例えば遺伝病等の種々の疾患の治療に DNA ポ リメ ラーゼが有効であることが今後発見されてく る可 能性があり、 それらの疾患の診断や治療の際には、 ヒ 卜 DNA ポリメラ一ゼが量的に生産確保されるこ とが必 須であり、 本発明によってそのような需要に十分対応 できる技術が提供された。
    权利要求:
    Claims

    請 求 の 範 囲 .
    . 以下のアミノ酸配列を含んでなるペプチ ド。 Met Ser Lys Arg Lys Ala Pro Gin Glu Thr Leu Asn GLy Giy lie Thr Asp Met Leu Val Glu Leu Ala Asn Phe Glu Lys . Asn Val Ser Gin Ala lie His Lys Tyr Asn Ala Tyr Arg Lys Ala Ala Ser Val He Ala Lys Tyr Pro His Lys lie Lys Ser Gly Ala Glu Ala Lys Lys Leu Pro Gly Val Gly Thr Lys lie Ala Glu Lys He As Glu Phe Leu Al Thr Gly Lys Leu Arg Lys Leu Glu Lys lie Arg Gin As Asp Thr Ser Ser Ser lie Asn Phe Le—u Thr krs Ί^ϊ Thr Gly lie Gly Pro Ser Ala Ala Arg Lys Leu Va 1 Asp Glu Gly lie Lys TJir Leu G 1 u A s Leu Arg Lys Asn Glu Asp Lys Leu Asn His His, Gin Arg He Gly Leu Lys Tyr Phe Glu A.s Phe Glu 'Lys Arg He Pro Arg Glu Glu Met Leu Gin Met Gin Asp lie Val Leu Asn Glu Val Lys Lys Leu Asp Pro Glu Tyr lie Ala Thr Val Cys Gly Ser Phe Arg Arg Gly Ala Glu Ser Ser Gly Asp Met Asp Val Leu Leu Thr His Pro Asn Phe Thr Ser Glu Ser Ser Lys 61n Pro Lys Leu Leu His Arg Val Val Glu Gin Leu Gin Lys Val Arg Phe lie Thr Asp Thr Arg Ser Lys
    Gly Glu Thr Lys Phe Met Gly Val Cys Gin Leu Pro Ser Glu Asn Asp Glu Asn Glu Tyr Pro His Arg Arg lie Asp lie Arg Leu lie Pro Lys Asp Gin Tyr Tyr Cys Gly Val Leu Tyr Phe Thr Gly Ser Asp He Phe Asn Lys Asn Met Arg Ala His Ala Leu Glu Lys Gly Phe Thr He Asn Glu Tyr Thr He Arg Pro Leu Gly Val Thr Gly Val Ala Gly Glu Pro Leu Pro Val Asp Ser Glu Gin Asp He Phe Asp Tyr lie Gin Trp Arg Tyr Arg Glu Pro , Lys Asp Arg Ser Glu
    2 . 動物が産生する DNAポ メ ラーゼをコー ドする DNA 配列を含む DNA配列。
    3 . 前記動物が産生する DNAポリメラ一ゼが特許請求 の範囲第 1 項に記載のアミノ酸配列を有するものであ. る特許請求の範囲第 2項に記載の DNA配列。
    4 . 前記動物が産生する DNAポリメラ一ゼをコー ドす る DNA配列が以下に示す塩基配列を有する特許請求の 範囲第 2項に記載の DNA 配列。
    ATGAGCAAAC GCAAGGCCCC GCAGGAGACC
    CTCAACGGCG GCATCACGGA CATGCTCGTG
    GAACTCGCAA ACTTTGAGAA GAACGTGAGC
    CAGGCGATCC ACAAGTACAA TGCATACAGA AAAGCAGCAT CTGTGATAGC AAAGTACCCA CACAAAATCA AGAGTGGAGC AGAAGCTAAG AAATTGCCAG GAGTAGGAAG AAAAATTGCT GAAAAGATTG ATGAATTTTT AGCAACTGGA AAATTGCGTA AACTGGAAAA GATTCGTCAG GATGATACAA GTTGATCCAT CAACTTCGTG ACTCGAGTTA CTGGCATCGG GCCATCTGCT GCAAGGAAGC TTGTAGATGA AGGAATTAAA
    iCATTAGAAG ATCTCAGGAA AAATGAAGAT AAATTGAACC ACCATCAGCG AATTGGGCTG AAATATTTTG AGGACTTTGA AAAGAGAATT CCTCGTGAGG AGAT&CTGCA TGCAGGAC ATTGTTCTTA ATGAAGTTAA AAAGCTGGAT CCCGAGTACA TCGCTACAGT CTGCGGCAGT TTCCGAAGAG GCGCAGAGTC CAGTGGAGAT ATGGACGTTC TGCTGACCCA CCCAAACTTC ACGTCAGAAT CAAGCAAACA GCGAAAGTTG TTACATCGTG TTGTGGAACA GTTACAAAAA GTCCGTTTCA TTACAGATAC TCGTTCAAAG GGTGAGACAA AGTTCATGGG TGTTTGCCAG CTTCCCAGCG AGAATGATGA AAACGAATAT CCACACAGGA GAATCGATAT CAGGTTGATC CCCAAAGATC AGTACTACTG TGGTGTTCTC TACTTCACTG GAAGTGACAT CTTTAATAAG AATATGA.GAG CGCATGCCCT GGAAAAGGGC
    TTCACAATCA ATGAGTACAC CATCCGCCCC CTGGGGGTCA CTGGGGTTGC TGGGGAGCCC CTTCCGGTGG ACAGCGAGCA GGACATTTTC GATTACATCC AGTGGCGCTA CCGGGAGCCC AAGGACAGGA GTGAATGA
    5 . 少なく と も宿主細胞中で複製可能な部分を有する ベクターと該ベクターと結合した動物が産生する DNA ポリメ ラーゼをコードする DNA配列を含む DNA 断片と を有してなる組換え体プラスミ ド。
    6 . 前記動物が産生する DNAボリメラーゼが特許請求 の範囲第 1 項に記載のァミノ酸配列を有するものであ る特許請求の範囲第 5項に記載の組換え体プラスミ ド。
    7. 前記動物が産生する DNAポリメラ一ゼをコー ドす る DNA 配列が特許請求の範囲第 4項に記載の塩基配列 を有する特許請求の範囲第 5項に記載の組換え体ブラ スミ ド。
    8. 前記ベクターがフ ァージを加えることによ り一本 鎖になる性質を有するものである特許請求の範囲第 5 項に記載の組換え体プラスミ ド。
    9. 前記ベクターがプラスミ ド pUC 118 由来の DNA フ ラグメン トであり、 前記 DNAポリメラーゼをコー ドす る DNA 配列が該フラグメン 卜のラク トースォペロンの プロモータ一下流 Jこ違結している特許請求の範囲第 5 項に記載の組換え体プラスミ ド。
    10. 特許請求の範囲第 5項に記載の組換え体プラスミ ドによつて形質転換された微生物若しく は細胞。
    11. 前記微生物が大腸菌である特許請求の範囲第 10項 に記載の微生物。
    12. 特許請求の範囲第 10項に記載の形質転換された微 生物若しく は細胞を培養する ことによる DNA ポ リ メ ラーゼの生産方法。
    13. 動物細胞が産生する DNA ポリメラーゼを含む混合 物から、 該 DNA ポ リ メ ラーゼを分離精製する方法で あって、 '
    a)該混合物を陰ィオン交換担体に接触させて処理 する過程と、
    b)前記陰ィオン交換担体に未吸着の画分を酸性担体 に接触させて処理する過程と、
    c)前記酸性担体に吸着した画分を、 溶出用液体の塩 濃度の差異を利甩して分画し、 DNA ポリメラ一ゼ活 性を有する画分を分籬する過程と、
    d)該 DNA ボリメラーゼ活性を有する画分をァフィ二 ティ ークロマ トグラフィ ーで処理し、 ポリ メ ラーゼを精製する過程と .
    を有してなることを特徵とする DNA ポリメラ一ゼの 分離精製方法。
    14. 前記混合物が、 動物細胞が産生する DNA ポ リ メ ラーゼをコー ドする DNA 配列を導入して形質転換した 微生物若し く は動物細胞に生産させた DNA ポリメ ラ一 ゼを含むものである特許請求の範囲第 11項に記載の DNA ポリ メ ラーゼの分離精製方法。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Yim et al.2013|Isolation of fully synthetic promoters for high‐level gene expression in Corynebacterium glutamicum
    Lloyd et al.1996|Torque generation in the flagellar motor of Escherichia coli: evidence of a direct role for FliG but not for FliM or FliN.
    Nishimura et al.1999|Molecular cloning and characterization of mammalian homologues of vesicle-associated membrane protein-associated | proteins
    Wedel et al.1998|Evolutionary conserved light regulation of Calvin cycle activity by NADPH-mediated reversible phosphoribulokinase/CP12/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase complex dissociation
    Suits et al.2008|Novel structure of the conserved gram-negative lipopolysaccharide transport protein A and mutagenesis analysis
    Kido et al.1996|RNase E polypeptides lacking a carboxyl-terminal half suppress a mukB mutation in Escherichia coli.
    Silber et al.1992|Tsp: a tail-specific protease that selectively degrades proteins with nonpolar C termini
    Harper et al.1993|Calcium and lipid regulation of an Arabidopsis protein kinase expressed in Escherichia coli
    Lopez et al.1987|Sulfonamide resistance in Streptococcus pneumoniae: DNA sequence of the gene encoding dihydropteroate synthase and characterization of the enzyme.
    Manstein et al.1995|Cloning vectors for the production of proteins in Dictyostelium discoideum
    Chen et al.1996|Aperiplasmic protein | of Escherichia coli selectively binds a class of outer membrane proteins
    Craig et al.1989|SSC1, an essential member of the yeast HSP70 multigene family, encodes a mitochondrial protein.
    Matsuyama et al.1995|A novel periplasmic carrier protein involved in the sorting and transport of Escherichia coli lipoproteins destined for the outer membrane.
    JP2686090B2|1997-12-08|新規融合蛋白質およびその精製方法
    ROSSMANN et al.1994|Maturation of the large subunit | of Escherichia coli hydrogenase 3 requires nickel incorporation followed by C‐terminal processing at Arg537
    Mengin-Lecreulx et al.1996|Identification of the mpl gene encoding UDP-N-acetylmuramate: L-alanyl-gamma-D-glutamyl-meso-diaminopimelate ligase in Escherichia coli and its role in recycling of cell wall peptidoglycan.
    De Keyzer et al.2003|The bacterial translocase: a dynamic protein channel complex
    CA2150928C|2005-02-08|Expression system for producing apolipoprotein ai-m
    Katayama et al.1988|The two-component, ATP-dependent Clp protease of Escherichia coli. Purification, cloning, and mutational analysis of the ATP-binding component.
    US4968613A|1990-11-06|Luciferase gene and novel recombinant DNA as well as a method of producing luciferase
    KIRINO et al.1994|Hydrophobic interaction at the subunit interface contributes to the thermostability of 3‐isopropylmalate dehydrogenase from an extreme thermophile, Thermus thermophilus
    Saunders et al.1987|Secretion of human serum albumin from Bacillus subtilis.
    Grove et al.1996|Escherichia coli K‐12 genes essential for the synthesis of c‐type cytochromes and a third nitrate reductase located in the periplasm
    Terashima et al.2006|The Vibrio motor proteins, MotX and MotY, are associated with the basal body of Na+‐driven flagella and required for stator formation
    Dailey et al.1996|Human protoporphyrinogen oxidase: expression, purification, and characterization of the cloned enzyme
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0293491A1|1988-12-07|
    JPS63152976A|1988-06-25|
    JPH0815429B2|1996-02-21|
    EP0293491A4|1990-03-21|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1988-06-16| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): US |
    1988-06-16| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1988-08-01| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1987907981 Country of ref document: EP |
    1988-12-07| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1987907981 Country of ref document: EP |
    1992-04-02| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1987907981 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    [返回顶部]